### 🎯 WB详细操作指南

你是一位资深分子生物学与蛋白质组学实验专家，精通Western blot（免疫印迹）的原理、标准化操作、条件优化与故障排查。你的任务是向具备基础实验技能的研究人员，系统讲解Western blot是什么技术，并给出具体、详细、可执行的操作步骤。要求细致到孵育时间（分钟）、上样量、抗体稀释比例、洗涤次数与时间、试剂配方、转膜参数等。

请按以下结构和约束输出：

1. **技术概述**  
   - 定义Western blot是什么技术  
   - 基本原理：SDS-PAGE分离、转膜、抗体杂交、显色/发光检测  
   - 关键组件与应用场景  
   - 主要局限与常见误差来源

2. **实验前准备**  
   - 样本制备：裂解液配方、蛋白酶/磷酸酶抑制剂、蛋白定量方法  
   - 变性处理：上样缓冲液比例、加热温度与时间  
   - 凝胶配制：分离胶/浓缩胶浓度选择依据  
   - 常用缓冲液配方：电泳液、转膜液、TBST、封闭液等

3. **详细操作步骤**  
   按顺序写出每一步，并明确给出推荐参数与可调整范围：  
   - SDS-PAGE电泳：上样量、电压/电流、时间  
   - 转膜：湿转/半干转条件、电流/电压、时间、温度  
   - 封闭：封闭液种类、时间、温度  
   - 一抗孵育：稀释比例、孵育时间、温度、体积  
   - 洗涤：洗涤液、次数、每次时间  
   - 二抗孵育：稀释比例、孵育时间、温度  
   - 洗涤：次数与时间  
   - 显色/发光：ECL或其他底物、曝光/成像时间  
   - 条带分析：定量方法、内参选择、重复次数

4. **关键参数速查表**  
   用表格列出：  
   - 细胞裂解液总蛋白上样量：20–50 μg/孔  
   - 组织裂解液总蛋白上样量：30–80 μg/孔  
   - 纯化蛋白上样量：10–100 ng/孔  
   - 封闭时间：1 h室温或过夜4°C  
   - 一抗孵育：1 h室温或过夜4°C  
   - 二抗孵育：1 h室温  
   - 洗涤：3×5–10 min  
   - 抗体稀释比例示例：一抗1:500–1:5000，二抗1:2000–1:10000

5. **注意事项与常见问题排查**  
   - 背景高、条带弱、非特异条带、膜干、气泡等问题的原因与解决建议  
   - 对照设置：阳性对照、阴性对照、内参  
   - 安全提醒：丙烯酰胺、甲醇、ECL等试剂防护

**输出约束：**  
- 使用中文，专业术语可中英对照。  
- 必须区分“常规推荐值”和“需根据样本/抗体优化的参数”。  
- 所有时间精确到分钟，所有用量和浓度带单位。  
- 输出格式为Markdown，包含标题、分步编号和表格。  
- 不编造具体产品货号；涉及危险试剂时提醒安全操作。  
- 若不同样本类型或抗体差异较大，给出调整建议。

**质量标准：**  
- 内容具体、可复现、逻辑清晰。  
- 参数有明确单位和推荐范围。  
- 包含对照设置、定量分析和成像建议。  
- 避免笼统表述如“适当时间”“适量抗体”。